基因測序儀一種用于確定DNA分子中核苷酸（即腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、胞嘧啶C、鳥嘌呤G）精確排列順序的核心生命科學儀器。隨著基因組學、精準醫療、病原體檢測和法醫學等領域的快速發展，基因測序儀已成為現代生命科學研究與臨床診斷中不可或缺的關鍵裝備。

（圖源網絡，侵刪）

從技術路線來看，目前主流的基因測序儀主要基于邊合成邊測序、邊連接邊測序或單分子實時測序等原理，但無論哪種技術路徑，其核心檢測環節大多依賴于熒光信號的光學檢測。熒光檢測法具有靈敏度高、多重檢測能力強、信噪比優良等優勢，因此成為基因測序領域應用最為廣泛的信號讀取方式。在熒光檢測體系中，光學濾光片作為光路系統的核心波長選擇元件，其性能直接決定了測序信號的采集質量、堿基識別準確率以及最終數據產出的可靠性。

一、基因測序儀工作原理

1.基本工作流程

以主流的邊合成邊測序（SBS）技術為例，其基本工作流程如下：

文庫制備：待測DNA片段經處理后連接接頭序列，形成測序文庫，并固定在流動池（FlowCell）表面。

橋式擴增：在流動池表面進行橋式PCR擴增，形成成千上萬個單克隆DNA簇，每個簇包含大量相同的DNA模板拷貝，以增強后續熒光信號強度。

邊合成邊測序：加入帶有熒光標記的可逆終止核苷酸（每個堿基對應一種特征熒光染料），在DNA聚合酶作用下進行延伸反應。每輪延伸只摻入一個堿基后即停止，隨后通過光學系統讀取該堿基的熒光信號。

信號讀取與堿基識別：激發光源照射DNA簇，熒光染料發出特征波長信號，經光學濾光片分光后由高靈敏度探測器（如CCD或CMOS相機）捕獲，通過分析信號波長和強度確定當前摻入的堿基類型。

循環重復：切除熒光標記和終止基團，進入下一輪延伸與讀取循環，直至完成全部序列測定。

（圖源網絡，侵刪）

2.熒光檢測的光學原理

在測序反應中，四種堿基（A、T、C、G）通常采用四色熒光標記體系，即每種堿基標記一種發射光譜特征不同的熒光染料。測序儀的光學系統需依次完成以下功能：

激發：光源（通常為固態激光器或多波長激光器）發出特定波長的激發光，照射樣本中DNA簇上的熒光染料分子，使其躍遷至激發態。

發射：熒光染料從激發態返回基態時，發射出波長更長的特征熒光信號。

分離與檢測：光學系統將混合的熒光信號按波長進行分離，由探測器分別捕獲各波長通道的信號強度，經算法解碼后判定堿基類型。

在這一過程中，光學濾光片是決定波長選擇精度和信號分離效果的關鍵元件。

二、測序儀光學系統核心元件

基因測序儀的光學系統主要包括以下核心元件：

1.激發光源

通常采用固態激光器或多波長激光器，輸出功率穩定、線寬窄、光束質量高的激發光。根據熒光染料的吸收光譜特征，常選用不同波長的激光器組合，以高效激發多種熒光染料。

2.光學濾光片組

這是整個光學系統的核心波長管理元件，通常以"濾光片組"的形式配套使用，具體包括：

激發濾光片：位于激發光源與樣本之間，用于提純激發光的波長。

二向色鏡：以特定角度（通常為45度）放置于光路交匯處，用于分離激發光與發射光。

發射濾光片：位于樣本與探測器之間，用于篩選目標熒光信號、阻擋雜散光。

3.聚焦與成像光學元件

包括物鏡、透鏡組、反射鏡等，用于將激發光匯聚至樣本，并將發射的熒光信號高效收集、準直和成像到探測器靶面上。

4.光電探測器

通常采用科學級CCD（電荷耦合器件）、sCMOS（科學互補金屬氧化物半導體）相機或光電倍增管（PMT），用于將光信號轉換為電信號進行量化記錄。

（NBP473窄帶濾光片）

三、光學濾光片及其關鍵參數分析

基因測序儀對光學濾光片有著極高的性能要求，以下從常規應用參數維度進行系統分析。

1.激發濾光片（ExcitationFilter）

功能定位：位于激發光光路中，用于從寬光譜光源中提取特定波段的激發光，同時徹底濾除光源中與激發無關的其他波長成分，防止非目標波長光進入樣本區域產生背景干擾。

常規應用參數要求：

中心波長（CWL）：需與所使用的熒光染料吸收峰精確匹配，常規中心波長常見于473nm、532nm、635nm、685nm等激光譜線附近，依據具體染料體系而定。

帶寬（FWHM，半高全寬）：通常為3nm～10nm，較窄的帶寬有助于保證激發光的高度單色性，減少非特異性激發。

峰值透射率：典型值要求大于90%，以最大化激發光能量利用率，降低光源功率需求。

截止深度（光密度OD值）：在截止波段要求OD≥5，有效阻擋光源的雜散發射和背景輻射。

截止波長范圍：通常覆蓋200nm～1200nm的寬光譜范圍。

（NBP635窄帶濾光片）

2.發射濾光片（EmissionFilter）

功能定位：位于樣本與探測器之間的發射光路中，用于選擇性地透過熒光染料發射的特征信號光，同時最大程度地阻擋激發光及其他雜散光到達探測器，是決定信噪比的核心環節。

常規應用參數要求：

中心波長（CWL）：需與熒光染料的發射峰精確對應，常規發射中心波長常見于510nm、570nm、670nm、710nm等位置，具體取決于熒光染料體系。

帶寬（FWHM）：通常為10nm～35nm。帶寬選擇需兼顧信號收集效率（帶寬越寬信號越強）和光譜分辨能力（帶寬越窄鄰道串擾越小），在主流四色體系中通常折中選擇在15nm～30nm區間。

峰值透射率：典型值要求大于90%，部分高性能濾光片可達95%以上，以最大限度保留微弱的熒光信號。

截止深度（光密度OD值）：這是發射濾光片最為關鍵的參數之一。在激發光波長位置及非目標熒光波段，要求OD≥6，對于高靈敏度系統甚至要求OD>8，以確保激發的雜散光被充分抑制。

陡度（EdgeSteepness）：定義為透射帶邊緣從高截止到高透射的波長過渡寬度，通常要求過渡帶寬度小于5nm，以保證在激發光波長與發射光波長非常接近時仍能有效分離。

截止波長范圍：覆蓋200nm～1200nm，確保全光譜范圍內無漏光。

（BP670帶通濾光片）

3.二向色鏡（DichroicMirror）

功能定位：以45度入射角放置在激發光路與發射光路的交匯點。其鍍膜設計使其對短波長（激發光）具有高反射率，對長波長（發射光）具有高透射率（或反之），從而實現激發光與發射光在空間上的分離。

常規應用參數要求：

截止/分界波長：位于激發光中心波長與發射光中心波長之間的中間區域，典型分界波長如500nm、580nm、650nm等，需針對具體染料對進行優化設計。

反射率：在激發光波長處要求反射率大于90%，部分可達到95%以上，以確保激發光高效反射至樣本。

透射率：在發射光波長處要求透射率大于90%，確保熒光信號高效透過到達探測器。

角度敏感性：由于其性能對入射角變化敏感，常規應用中要求在45°±2°范圍內性能指標保持穩定。

（500二向色鏡）

4.多通道濾光片組的協同工作

在基因測序儀中，上述三類濾光片并非獨立工作，而是構成一個精密匹配的光學濾光片組。激發濾光片、二向色鏡和發射濾光片三者的光譜特性需協同設計，確保：

激發濾光片的透射帶與二向色鏡的反射帶重疊；

二向色鏡的透射帶與發射濾光片的透射帶重疊；

發射濾光片的截止帶與激發濾光片的透射帶及二向色鏡的反射帶重疊，實現多重阻擋。

五、濾光片參數對測序性能的影響

光學濾光片的各項參數直接關系到基因測序儀的核心性能指標

光學濾光片作為基因測序儀光學檢測系統的核心波長管理元件，通過激發濾光片、發射濾光片和二向色鏡的精密組合，實現了對熒光激發和發射信號的高效、高選擇性控制。其中心波長、帶寬、透射率、截止深度、陡度等關鍵參數的優化設計，直接決定了測序儀的信號靈敏度、信噪比和多色串擾抑制能力，最終影響堿基識別準確率與數據產出質量。

隨著基因測序技術向更長讀長、更高通量、更快速檢測和更低成本的方向持續演進，對光學濾光片在光譜精度、環境穩定性、批次一致性及膜系可靠性等方面的要求也將不斷提升。精密光學濾光片設計與制造技術的進步，將持續為基因測序技術的發展提供堅實的光學基礎支撐。